Le Western Blot est une technique de détection de protéines, utilisée dans le diagnostic de certaines infections virales notamment dans la confirmation du VIH. Tout ce qu'il faut savoir sur ce procédé dans la suite de notre article.
Qu'est-ce que le Western Blot ?
Le Western Blot, appelé aussi immuno-transfert, est une technique de biologie moléculaire qui consiste à analyser les protéines d'un mélange à l'aide d'anticorps dirigés contre ces protéines. Le procédé comporte plusieurs étapes à travers lesquelles les protéines migrent en fonction de leur charge ou de leur masse avant d'être identifiées par des marqueurs spécifiques.
La technique porte ce nom en référence à la technique de Southern, méthode de détection de séquences d'ADN inventée par Edwin Southern qui a également inspiré le nom de la technique de Northern dans la détection de l'ARN.
Blot signifie « buvard » en anglais, aussi le terme « Western Blot » désigne la deuxième étape de la méthode (celle du transfert), mais par abus de langage il est employé pour parler de l'intégralité du procédé.
Quelles sont les étapes du Western Blot ?
Le Western Blot comprend trois étapes distinctes : la séparation sur gel d'électrophorèse, le transfert sur membrane, et la révélation.
1re étape : séparation des protéines
La première étape vise à séparer les protéines par une électrophorèse c'est-à-dire l'application d'un champ électrique entraînant la migration des particules chargées. Le mélange contenant les protéines est déposé dans un gel au sein d'une matrice dont la nature varie en fonction du critère de tri des protéines (masse, charge électrique, pH).
Les différentes méthodes de séparation peuvent être combinées. À l'issue de cette étape, on obtient des bandes homogènes de protéines.
2e étape du Western Blot : transfert
La deuxième étape est celle du transfert des bandes de protéines vers une membrane porteuse, par un même système d'électrophorèse sur un support (nylon, nitrocellulose, PVDF) dont les caractéristiques sont différentes de celles du gel par sa porosité et son pH.
La membrane est mise au contact du gel et un courant électrique est appliqué afin que les protéines migrent du gel à la membrane, en gardant l'organisation qu'elles avaient entre elles dans le gel. Cette étape rend les protéines accessibles à la détection par les anticorps.
3e étape : révélation
La révélation vise à rechercher les protéines d'intérêt sur la membrane au moyen d'anticorps marqués. Cela nécessite des anticorps primaires et des anticorps secondaires.
Chaque anticorps primaire reconnaît une bande protéique spécifique à laquelle il se lie. Après rinçage des anticorps libres, les anticorps fixés sur leurs protéines sont reconnus par un second anticorps conjugué à un marqueur fluorescent, radioactif ou enzymatique ce qui provoque, grâce à l'ajout d'un réactif, une coloration, une émission de lumière ou une image radiographique.
Différentes applications du Western Blot
Western Blot : dans quel but est-il réalisé ?
La méthode du Western Blot est couramment utilisée dans les laboratoires dans la détection de certaines infections sur des échantillons sanguins, plus précisément dans le sérum, partie liquide du sang. Elle est parfois réalisée sur d'autres liquides biologiques comme le liquide céphalo-rachidien, le liquide pleural, le liquide de lavage broncho-alvéolaire, ou d'autres tissus.
Le Western Blot recherche des protéines virales ou des anticorps produits par le système immunitaire contre le virus. Les anticorps, appelés immunoglobulines, sont aussi des protéines. En cas d'infection récente, l'organisme produit des immunoglobulines M (IgM) et plus tard apparaissent des immunoglobulines G (IgG). Lorsque l'on cherche des anticorps dans le sérum, on parle de sérologie.
Sérologie par Western Blot
La sérologie par Western Blot met en évidence un contact plus ou moins récent avec le germe suspecté. Sa positivité signifie que l'organisme a été en contact avec le germe et qu'il a synthétisé des anticorps. En fonction du type d'anticorps retrouvé, de sa concentration et du contexte clinique, le médecin déduit s'il s'agit d'une infection récente ou ancienne.
Il diffère de la sérologie ELISA qui recherche de façon quantitative et automatisée des anticorps (IgM et IgG) en mettant le sérum au contact de divers antigènes commerciaux et détecte la formation des complexes antigènes-anticorps. Elle est utilisée comme moyen de dépistage.
Le Western Blot permet un dosage qualitatif dans le sens où il identifie plus précisément les différents types d'anticorps. Cette caractéristique permet d'éliminer les faux positifs (sérologie positive alors que le patient n'est pas infecté) et lui confère une plus grande spécificité.
Inconvénients du Western blot
La limite du Western Blot, au même titre que d'autres méthodes de diagnostic indirect, est son interprétation parfois délicate. Il existe de surcroît un risque de réactions croisées qui altère la fiabilité de l'examen.
De plus, il présente l'inconvénient d'être un examen long à réaliser par rapport au test ELISA.
Dans quels cas le Western blot est-il prescrit ?
Le Western Blot est la méthode de référence utilisée dans la confirmation de l'infection par le VIH en cas de test ELISA positif, mais aussi dans la confirmation de la maladie de Lyme et de l'encéphalopathie spongiforme bovine (maladie de la vache folle).